Meie ümber on palju laulmata kangelasi, kes tunduvad tavalised, kuid tegelikult panustavad nad vaikselt meie heaks palju. Proteinaas K on molekulaardiagnostika valdkonnas "laulmata kangelane", kuigi võrreldes valdkonna "suurte ja võimsatega" on proteinaas K nii tagasihoidlik, et oleme selle olulisuse juba ammu tähelepanuta jätnud. Uue koroonaepideemia puhkemisega on proteinaas K nõudlus hüppeliselt kasvanud ning pakkumine nii kodu- kui ka välismaal jääb tarbimisest kaugele maha ja kõik said äkki aru, kui oluline proteinaas K on.
Mis on proteinaas K kasutusala?
Proteinaas K on seriinproteaas, millel on proteolüütiline ensüümaktiivsus ja mis suudab säilitada aktiivsuse laias keskkonnavahemikus (pH (4–12,5), kõrge soolasisaldusega puhver, kõrge temperatuur 70 °C jne). Lisaks ei inhibeeri SDS, uurea, EDTA, guanidiinvesinikkloriid, guanidiini isotiotsüanaat jne proteinaas K aktiivsust ning teatud kogus pesuvahendit võib samuti proteinaas K aktiivsust suurendada. Meditsiinilises ravis (viiruste ja mikroobide desinfitseerimine), toidus (liha pehmendamine), naha töötlemisel (juuste pehmendamine), veinivalmistamisel (alkoholi selitamine), aminohapete valmistamisel (lagunenud suled), nukleiinhapete ekstraheerimisel, in situ hübridisatsioonil jne on proteinaas K-l rakendusi. Kõige sagedamini kasutatav rakendus on nukleiinhapete ekstraheerimine.
Proteinaas K suudab proovis ensümolüüsida igasuguseid valke, sealhulgas histoone, mis on tihedalt seotud nukleiinhapetega, nii et nukleiinhapped saab proovist vabastada ja ekstrakti viia, hõlbustades järgmist ekstraheerimise ja puhastamise etappi. Viiruse nukleiinhappe tuvastamisel on proteinaas K viiruse proovilahuse üks olulisi komponente. Proteinaas K suudab lõhkuda ja inaktiveerida viiruse kattevalku, mis on transportimise ja tuvastamise etapis ohutum; lisaks suudab proteinaas K lagundada ka RNaas, mis hoiab ära viiruse RNA lagunemise ja hõlbustab nukleiinhappe tuvastamist.
Proteinaas K üleöö kuulsus
Olgu tegemist teadusuuringute või IVD-ga, on nukleiinhapete ekstraheerimine kõige elementaarsem eksperiment, seega on proteinaas K alati olnud väga oluline. Varem oli proteinaas K aga palju vähem tuntud kui selle roll. Suur osa sellest oli tingitud proteinaas K pakkumise ja nõudluse väga stabiilsest vahekorrast. Vähesed inimesed arvaks, et proteinaas K pakkumine võib olla probleem.
Uue koroonaepideemia puhkemisega on nõudlus nukleiinhapete testimise järele hüppeliselt kasvanud. 2020. aasta juuni lõpu seisuga oli Hiinas tehtud ligi 90 miljonit uut koroonatesti ja see arv on ülemaailmsel tasandil veelgi murettekitavam. Nukleiinhapete ekstraheerimise katsetes on proteinaas K töökontsentratsioon umbes 50–200 μg/ml. Üldiselt kulub nukleiinhappe proovi ekstraheerimiseks umbes 100 μg proteinaas K-d. Tegelikus kasutuses kasutatakse nukleiinhapete ekstraheerimise efektiivsuse suurendamiseks proteinaas K-d sageli suuremas koguses. Uue koroonaviiruse nukleiinhapete tuvastamine on toonud kaasa suure nõudluse proteinaas K järele. Proteinaas K algne pakkumise ja nõudluse tasakaal purunes kiiresti ning proteinaas K-st sai üleöö oluline epideemia ennetamise materjal.
Raskused proteinaas K tootmisel
Kuigi epideemia arenedes on inimesed proteinaas K olulist väärtust hakanud hindama, on piinlik, et proteinaas K liigse tagasihoidlikkuse tõttu on selle tootmisega tegelenud vaid vähesed kodumaised ettevõtted. Kui inimesed soovivad proteinaas K tootmist alustada, avastati tootmisprotsessi käigus, et proteinaas K on äärmiselt eriline valk. Proteinaas K tootmisvõimsuse suurendamine lühikese aja jooksul on äärmiselt keeruline.
Proteinaas K suuremahuline tootmine seisab silmitsi järgmiste raskustega
1. Madal väljendus
Proteinaas K suudab mittespetsiifiliselt lagundada enamikku valke ja põhjustada ekspressiooni peremeesrakule tõsist toksilisust. Seetõttu on proteinaas K ekspressioonitase üldiselt väga madal. Ekspressioonisüsteemide ja tüvede, mis ekspresseerivad proteinaas K-d kõrgel tasemel, skriining nõuab üldiselt pikemat tsüklit.
2. Pigmentide ja nukleiinhapete jäägid
Ulatusliku kääritamise käigus tekib suur hulk pigmenti ja peremeesorganismi nukleiinhappe jääke. Neid lisandeid on lihtsa puhastusprotsessiga keeruline eemaldada ning keerukas puhastamine suurendab kulusid ja vähendab taaskasutusmäära.
3. Ebastabiilsus
Proteinaas K ei ole piisavalt stabiilne, see võib ennast ensümolüüsida ja seda on raske ilma kaitsva aineta pikka aega stabiilselt 37°C juures säilitada.
4. Lihtne sadestuda
Proteinaas K külmkuivatatud pulbri valmistamisel on külmkuivatatud pulbris suure tahke aine sisalduse tagamiseks vaja lisada külmkuivatatud kaitseainet suures kontsentratsioonis, kuid kui proteinaas K kontsentratsioon ulatub 20 mg/ml-ni ja üle selle, on agregatsioon lihtne. Sade moodustab saendi, mis raskendab suure tahke aine sisaldusega proteinaas K külmkuivatamist.
5. Suured investeeringud
Proteinaas K-l on tugev proteaasiaktiivsus ja see suudab laboris teisi proteaase hüdrolüüsida. Seetõttu vajab proteinaas K uurimis- ja arendustegevuseks ning tootmiseks spetsiaalseid tootmisruume, seadmeid ja personali.
XD BIOCHEMi proteinaas K lahus
XD BIOCHEMil on küps valkude ekspressiooni- ja puhastamisplatvorm ning rikkalik kogemus rekombinantsete valkude ekspressioonis ja puhastamises ning tootmisprotsesside optimeerimises. Teadus- ja arendusmeeskonna kiire moodustamise abil on ületatud proteinaas K suuremahuline tootmisprotsess. Külmkuivatatud pulbri kuutoodang on üle 30 kg. Tootel on stabiilne jõudlus, kõrge ensüümispetsiifiline aktiivsus ning see ei sisalda peremeesorganismi tsütokroomi ega nukleiinhappejääke. Võtke ühendust XD BIOCHEMiga, et saada proovipakett (e-post:sales@xdbiochem.comTel: +86 513 81163739).
XD BIOCHEMi tehnilised lahendused hõlmavad järgmist
Mitme koopia plasmiidi integreerimise abil valitakse välja kõrge ekspressioonitasemega tüved ekspressioonitasemega 8 g/l, mis ületab proteinaas K madala ekspressioonitaseme probleemi.
Mitmeastmelise puhastusprotsessi abil eemaldati edukalt peremeesorganismi tsütokroom ja proteinaas K nukleiinhappejäägid alla standardväärtuse.
Kaitsev puhverformulatsioonide suure läbilaskevõimega sõelumise abil valiti välja puhver, mis suudab proteinaas K-d stabiilselt säilitada temperatuuril 37 °C.
Sõelumispuhvrid ületavad probleemi, et proteinaas K-d on suurtes kontsentratsioonides lihtne agregeerida ja sadestada, ning loovad aluse proteinaas K kõrge tahke aine sisaldusega külmkuivatamiseks.
XD BIOCHEM proteinaas K proov
XD BIOCHEM proteinaas K stabiilsustest: toatemperatuuril 80 päeva möödudes ei toimu aktiivsuses olulisi muutusi
XD BIOCHEM proteinaas K stabiilsustest: 80 päeva möödudes toatemperatuuril ei toimu aktiivsuses olulisi muutusi.
XD BIOCHEM proteinaas K ja konkureerivate toodete nukleiinhapete ekstraheerimise efekti võrdlus. Nukleiinhapete ekstraheerimise protsessis kasutatakse vastavalt XD BIOCHEM ja konkureerivat proteinaas K-d. XD BIOCHEM proteinaas K ekstraheerimise efektiivsus on kõrgem ja sihtgeeni Ct-väärtus on madalam.
Postituse aeg: 31. detsember 2021