IPTG (isopropüül-β-D-tiogalaktosiid) on β-galaktosidaasi substraadi analoog, mis on väga indutseeritav. IPTG indutseerimise korral võib indutseerija moodustada repressorvalguga kompleksi, mille tulemusel repressorvalgu konformatsioon muutub nii, et see ei saa enam sihtgeeniga kombineeruda ja sihtgeen ekspresseerub tõhusalt. Kuidas siis IPTG kontsentratsiooni katse ajal määrata? Kas mida suurem, seda parem?
Esmalt mõistame IPTG induktsiooni põhimõtet: E. coli laktoosoperon (element) sisaldab kolme struktuurgeeni, Z, Y ja A, mis kodeerivad vastavalt β-galaktosidaasi, permeaasi ja atsetüültransferaasi. lacZ hüdrolüüsib laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks või allo-laktoosiks; lacY laseb keskkonnas oleval laktoosil läbida rakumembraani ja siseneda rakku; lacA kannab atsetüülrühma atsetüül-CoA-st β-galaktosiidile, mis hõlmab toksilise efekti kõrvaldamist. Lisaks on olemas operatiivjärjestus O, algjärjestus P ja regulatiivne geen I. I geeni kood on repressorvalk, mis saab seonduda operaatorjärjestuse O positsiooniga, nii et operon (meta) represseeritakse ja lülitatakse välja. Samuti on olemas kataboolse geeni aktivaatorvalgu-CAP sidumissaidi sidumissait initsieeriva järjestuse P ülesvoolu. P-järjestus, O-järjestus ja CAP sidumissait moodustavad koos lac-operoni regulatiivse piirkonna. Kolme ensüümi kodeerivaid geene reguleerib sama regulatiivne piirkond, et saavutada geeniproduktide koordineeritud ekspressioon.
Laktoosi puudumisel on lac-operon (meta) repressiooniseisundis. Sel ajal seondub PI promootorjärjestuse kontrolli all oleva I-järjestuse poolt ekspresseeritud lac-repressor O-järjestusega, mis takistab RNA polümeraasi seondumist P-järjestusega ja pärsib transkriptsiooni initsieerimist; laktoosi olemasolul saab indutseerida lac-operoni (meta). Selles operoni (meta) süsteemis ei ole tegelik indutseerija laktoos ise. Laktoos siseneb rakku ja β-galaktosidaas katalüüsib selle muundumist allolaktoosiks. Viimane indutseeriva molekulina seondub repressorvalguga ja muudab valgu konformatsiooni, mis viib repressorvalgu dissotsiatsioonini O-järjestusest ja transkriptsioonini. Isopropüültiogalaktosiidil (IPTG) on sama toime kui allolaktoosil. See on väga võimas indutseerija, mida bakterid ei metaboliseeri ja mis on väga stabiilne, mistõttu seda kasutatakse laialdaselt laborites.
Kuidas määrata IPTG optimaalset kontsentratsiooni? Võtame näiteks E. coli.
Positiivset rekombinantset pGEX-i (CGRP/msCT) sisaldav geneetiliselt muundatud E. coli BL21 tüvi inokuleeriti LB vedelkeskkonda, mis sisaldas 50 μg·ml-1 Amp, ja kultiveeriti üleöö temperatuuril 37 °C. Eespool nimetatud kultuur inokuleeriti 10 pudelisse 50 ml värske LB vedelkeskkonnaga, mis sisaldas 50 μg·ml-1 Amp, suhtega 1:100 laienduskultuuri jaoks, ja kui OD600 väärtus oli 0,6–0,8, lisati IPTG lõppkontsentratsioonini. See on 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Pärast indutseerimist samal temperatuuril ja samal ajal võeti sellest 1 ml bakterilahust, bakterirakud koguti tsentrifuugimise teel ja viidi läbi SDS-PAGE elektroforeesi, et analüüsida erinevate IPTG kontsentratsioonide mõju valgu ekspressioonile ning seejärel valida IPTG kontsentratsioon, millel on suurim valgu ekspressioon.
Pärast katseid selgub, et IPTG kontsentratsioon ei ole võimalikult suur. Selle põhjuseks on IPTG teatav toksilisus bakterite suhtes. Kontsentratsiooni ületamine hävitab ka raku; ja üldiselt loodame, et mida rohkem lahustuvat valku rakus ekspresseeritakse, seda parem, kuid paljudel juhtudel, kui IPTG kontsentratsioon on liiga kõrge, moodustub suur hulk inklusioone. Keha, kuid lahustuva valgu hulk väheneb. Seetõttu ei ole kõige sobivam IPTG kontsentratsioon sageli mitte see, et mida suurem, seda parem, vaid see, et mida madalam on kontsentratsioon.
Geneetiliselt muundatud tüvede indutseerimise ja kultiveerimise eesmärk on suurendada sihtvalgu saagist ja vähendada kulusid. Sihtgeeni ekspressiooni ei mõjuta mitte ainult tüve enda faktorid ja ekspressiooniplasmiid, vaid ka muud välised tingimused, näiteks indutseerija kontsentratsioon, induktsioonitemperatuur ja induktsiooniaeg. Seetõttu on enne tundmatu valgu ekspresseerimist ja puhastamist üldiselt kõige parem uurida indutseerimise aega, temperatuuri ja IPTG kontsentratsiooni, et valida sobivad tingimused ja saada parimad eksperimentaalsed tulemused.
Postituse aeg: 31. detsember 2021