IPTG (isopropüül-β-D-tiogalaktosiid) on β-galaktosidaasi substraadi analoog, mis on väga indutseeritav.IPTG indutseerimisel võib indutseerija moodustada kompleksi repressorvalguga, nii et repressorvalgu konformatsioon muutub, nii et seda ei saa kombineerida sihtgeeniga ja sihtgeen ekspresseerub tõhusalt.Niisiis, kuidas tuleks katse ajal määrata IPTG kontsentratsioon?Kas mida suurem, seda parem?
Esiteks mõistame IPTG induktsiooni põhimõtet: E. coli laktoosi operon (element) sisaldab kolme struktuurigeeni Z, Y ja A, mis kodeerivad vastavalt β-galaktosidaasi, permeaasi ja atsetüültransferaasi.lacZ hüdrolüüsib laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks või allo-laktoosiks;lacY laseb keskkonnas oleval laktoosil läbi rakumembraani ja siseneb rakku;lacA kannab atsetüülrühma atsetüül-CoA-st β-galaktosiidile, mis hõlmab toksilise toime eemaldamist.Lisaks on toimiv järjestus O, lähtejärjestus P ja regulaatorgeen I. I geenikood on repressorvalk, mis suudab seonduda operaatorjärjestuse positsiooniga O, nii et operon (meta) represseeritakse ja välja lülitatud.Sidumiskoht on ka kataboolse geeni aktivaatorvalgu-CAP-i sidumissaidile initsieerivast järjestusest P ülesvoolu. P-järjestus, O-järjestus ja CAP-i sidumissait moodustavad koos lac-operoni regulatoorse piirkonna.Kolme ensüümi kodeerivaid geene reguleerib sama reguleeriv piirkond, et saavutada geeniproduktide koordineeritud ekspressioon.
Laktoosi puudumisel on lac operon (meta) represseeritud seisundis.Sel ajal seondub PI promootorjärjestuse kontrolli all oleva I järjestuse poolt ekspresseeritud lac-repressor O järjestusega, mis takistab RNA polümeraasi seondumist P järjestusega ja pärsib transkriptsiooni initsiatsiooni;kui laktoos on olemas, saab indutseerida lac-operoni (meta). Selles operoni (meta) süsteemis ei ole tegelik indutseerija laktoos ise.Laktoos siseneb rakku ja seda katalüüsib β-galaktosidaas, mis muundatakse allolaktoosiks.Viimane seondub indutseeriva molekulina repressorvalguga ja muudab valgu konformatsiooni, mis viib repressorvalgu dissotsieerumiseni O järjestusest ja transkriptsioonist.Isopropüültiogalaktosiidil (IPTG) on sama toime kui allolaktoosil.See on väga võimas indutseerija, mida bakterid ei metaboliseeru ja on väga stabiilne, mistõttu seda kasutatakse laialdaselt laborites.
Kuidas määrata IPTG optimaalset kontsentratsiooni?Võtke näiteks E. coli.
E. coli BL21 geneetiliselt muundatud tüvi, mis sisaldas positiivset rekombinantset pGEX-i (CGRP/msCT), inokuleeriti vedelasse LB söötmesse, mis sisaldas 50 µg·mL-1 Amp, ja kultiveeriti üleöö temperatuuril 37 °C.Ülaltoodud kultuur inokuleeriti 10 pudelisse 50 ml värske LB vedelsöötmega, mis sisaldas 50 μg · ml-1 Amp vahekorras 1:100 ekspansioonikultuuri jaoks ja kui OD600 väärtus oli 0,6-0,8, lisati IPTG lõppkontsentratsioonile.See on 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Pärast induktsiooni samal temperatuuril ja samal ajal võeti sellest 1 ml bakterilahust ning bakterirakud koguti tsentrifuugimise teel ja allutati SDS-PAGE-le, et analüüsida erinevate IPTG kontsentratsioonide mõju valgu ekspressioonile. valige suurima valguekspressiooniga IPTG kontsentratsioon.
Pärast katseid selgub, et IPTG kontsentratsioon ei ole nii suur kui võimalik.Seda seetõttu, et IPTG-l on bakteritele teatav toksilisus.Kontsentratsiooni ületamine tapab ka raku;ja üldiselt loodame, et mida lahustuvam valk rakus ekspresseerub, seda parem, kuid paljudel juhtudel, kui IPTG kontsentratsioon on liiga kõrge, tekib suur hulk inklusiooni.Keha, kuid lahustuva valgu kogus vähenes.Seetõttu ei ole kõige sobivam IPTG kontsentratsioon sageli seda suurem, seda parem, vaid seda madalam on kontsentratsioon.
Geneetiliselt muundatud tüvede esilekutsumise ja kasvatamise eesmärk on suurendada sihtvalgu saagist ja vähendada kulusid.Sihtgeeni ekspressiooni ei mõjuta mitte ainult tüve enda faktorid ja ekspressiooniplasmiid, vaid ka muud välised tingimused, nagu indutseerija kontsentratsioon, indutseerimistemperatuur ja induktsiooniaeg.Seetõttu on üldiselt enne tundmatu valgu ekspresseerimist ja puhastamist kõige parem uurida induktsiooniaega, temperatuuri ja IPTG kontsentratsiooni, et valida sobivad tingimused ja saada parimad katsetulemused.
Postitusaeg: 31. detsember 2021