Ditiotreitool (DTT) on laialdaselt kasutatav redutseerija, tuntud ka kui uus roheline lisand. See on väikemolekulaarne orgaaniline ühend, millel on kaks merkaptaanrühma (-SH). Tänu oma redutseerivatele omadustele ja stabiilsusele kasutatakse DTT-d laialdaselt biokeemias ja molekulaarbioloogias.
DTT peamine roll on disulfiidsidemete vähendamine valkudes ja teistes biomolekulides. Disulfiidside on valgu voltimise ja stabiilsuse oluline osa, kuid teatud katsetingimustes, näiteks redutseeritava SDS-PAGE analüüsi, valgu rekombinatsiooni ja voltimise korral, on vaja disulfiidside redutseerida kaheks tioolrühmaks, et lahti harutada valgu ruumiline struktuur. DTT suudab disulfiidsidemetega reageerida, et redutseerida need merkaptaanrühmadeks, avades seeläbi valgu ruumilise struktuuri ning muutes selle analüüsimise ja manipuleerimise lihtsaks.
DTT-d saab kasutada ka ensüümi aktiivsuse ja stabiilsuse kaitsmiseks. Mõnedes ensüümkatalüüsitud reaktsioonides võib oksüdeerija ensüümi aktiivsust vähendada. DTT võib reageerida oksüdeerijatega, et redutseerida need kahjututeks aineteks, kaitstes seeläbi ensüümi aktiivsust ja stabiilsust.
Võrreldes traditsiooniliste redutseerijatega, näiteks β-merkaptoetanooliga (β-ME), peetakse DTT-d ohutumaks ja stabiilsemaks redutseerijaks. See on stabiilne mitte ainult vesilahuses, vaid säilitab oma redutseerivad omadused ka kõrgel temperatuuril ja happe-aluse keskkonnas.
DTT kasutamine on suhteliselt lihtne. Üldiselt lahustatakse DTT sobivas puhvris ja lisatakse seejärel eksperimentaalsesse süsteemi. DTT optimaalne kontsentratsioon tuleb määrata vastavalt konkreetsele katsele ja seda kasutatakse üldiselt vahemikus 0,1–1 mM. Madalamad kontsentratsioonid võivad vähendada kahjulikku mõju rakkude kasvule ja sihtvalkude üleekspressioonist tingitud tsütotoksilisust. Kõrgemad kontsentratsioonid võivad põhjustada liigset rakkude ainevahetuskoormust, mõjutades rakkude kasvu ja ekspressiooni efektiivsust.
Optimaalse kontsentratsiooni määramise viisiks on sihtvalgu ekspressioonitaseme hindamine, viies läbi IPTG induktsiooniteste erinevatel kontsentratsioonidel. Väikesemahulisi kultuuriteste saab läbi viia, kasutades erinevaid IPTG kontsentratsioone (nt 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM jne) ja ekspressiooniefekti erinevatel kontsentratsioonidel saab hinnata sihtvalgu ekspressioonitaseme tuvastamise teel (nt Western blot või fluorestsentsdetektsioon). Katsetulemuste põhjal valiti optimaalseks kontsentratsiooniks parima ekspressiooniefektiga kontsentratsioon.
Lisaks võite sarnaste katsetingimuste korral tavaliselt kasutatava IPTG kontsentratsioonivahemiku mõistmiseks viidata ka asjakohasele kirjandusele või teiste laborite kogemustele ning seejärel optimeerida ja kohandada vastavalt katsevajadustele.
Oluline on märkida, et optimaalne kontsentratsioon võib varieeruda sõltuvalt erinevatest ekspressioonisüsteemidest, sihtvalkudest ja katsetingimustest, seega on kõige parem optimeerida igal üksikjuhul eraldi.
Kokkuvõttes on DTT tavaliselt kasutatav redutseerija, mida saab kasutada valkude ja teiste biomolekulide disulfiidsidemete vähendamiseks ning ensüümi aktiivsuse ja stabiilsuse kaitsmiseks. Seda on laialdaselt kasutatud biokeemia ja molekulaarbioloogia katsetes.
Postituse aeg: 28. september 2023