Ditiotreitool (DTT) on tavaliselt kasutatav redutseeriv aine, mida tuntakse ka uue rohelise lisandina.See on väikemolekulaarne orgaaniline ühend, millel on kaks merkaptaanrühma (-SH).Tänu redutseerivatele omadustele ja stabiilsusele kasutatakse DTT-d laialdaselt biokeemia ja molekulaarbioloogia katsetes.
DTT põhiülesanne on vähendada disulfiidsidemeid valkudes ja teistes biomolekulides.Disulfiidside on valgu voltimise ja stabiilsuse oluline osa, kuid teatud katsetingimustes, nagu redutseeritav SDS-PAGE analüüs, valgu rekombinatsioon ja voltimine, on vaja disulfiidsideme redutseerida kaheks tioolrühmaks, et lahti harutada valgu ruumiline struktuur. valku.DTT võib reageerida disulfiidsidemetega, redutseerides need merkaptaanrühmadeks, avades seega valgu ruumilise struktuuri ning muutes selle analüüsimise ja manipuleerimise lihtsaks.
DTT-d saab kasutada ka ensüümi aktiivsuse ja stabiilsuse kaitsmiseks.Mõne ensüümi poolt katalüüsitud reaktsiooni korral võib oksüdeerija vähendada ensüümi aktiivsust.DTT võib reageerida oksüdeerijatega, muutes need kahjututeks aineteks, kaitstes seeläbi ensüümi aktiivsust ja stabiilsust.
Võrreldes traditsiooniliste redutseerivate ainetega nagu β-merkaptoetanool (β-ME), peetakse DTT-d ohutumaks ja stabiilsemaks redutseerivaks aineks.See pole mitte ainult vesilahuses stabiilne, vaid säilitab ka oma redutseerivad omadused kõrgel temperatuuril ja happe-aluse tingimustes.
DTT kasutamine on suhteliselt lihtne.Üldiselt lahustatakse DTT sobivas puhvris ja lisatakse seejärel katsesüsteemi.DTT optimaalne kontsentratsioon tuleb määrata vastavalt konkreetsele katsele ja seda kasutatakse tavaliselt vahemikus 0,1-1 mM.Madalamad kontsentratsioonid võivad vähendada kahjulikku mõju rakkude kasvule ja vähendada sihtvalkude üleekspressioonist tingitud tsütotoksilisust.Kõrgemad kontsentratsioonid võivad põhjustada rakkude liigset metaboolset koormust, mõjutades rakkude kasvu ja ekspressioonitõhusust.
Optimaalse kontsentratsiooni määramise viis võib olla sihtvalgu ekspressioonitaseme hindamine, viies läbi erinevatel kontsentratsioonidel IPTG induktsioonitestid.Väikesemahulisi kultiveerimiskatseid saab läbi viia, kasutades erinevaid IPTG kontsentratsioone (nt 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM jne) ja ekspressiooniefekti erinevatel kontsentratsioonidel saab hinnata sihtvalgu (nt Westerni valgu) ekspressioonitaseme tuvastamise teel. blot või fluorestsentsi tuvastamine).Vastavalt katsetulemustele valiti optimaalseks kontsentratsiooniks parima ekspressiooniefektiga kontsentratsioon.
Lisaks võite viidata ka vastavale kirjandusele või teiste laborite kogemustele, et mõista tavaliselt kasutatavat IPTG kontsentratsioonivahemikku sarnastes katsetingimustes ning seejärel optimeerida ja kohandada vastavalt katsevajadustele.
Oluline on märkida, et optimaalne kontsentratsioon võib varieeruda sõltuvalt erinevatest ekspressioonisüsteemidest, sihtvalkudest ja katsetingimustest, seega on kõige parem optimeerida iga juhtumi puhul eraldi.
Kokkuvõttes on DTT laialt kasutatav redutseerija, mida saab kasutada valkude ja teiste biomolekulide disulfiidsidemete vähendamiseks ning ensüümi aktiivsuse ja stabiilsuse kaitsmiseks.Seda on laialdaselt kasutatud biokeemia ja molekulaarbioloogia katsetes.
Postitusaeg: 28. september 2023